在免疫檢測領(lǐng)域，維多珠ELISA試劑盒憑借高特異性、強抗干擾性和微量樣本適配性，成為科研與臨床檢測的“利器”。但實驗結(jié)果的高度可重復(fù)性，離不開標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程(SOP)。本文梳理關(guān)鍵步驟與注意事項，助您高效完成檢測。
一、實驗前準(zhǔn)備：細節(jié)決定成敗
首先核對試劑盒組分(酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、抗體預(yù)混液、顯色劑等)是否齊全，檢查有效期及儲存條件(通常2-8℃避光保存)。根據(jù)樣本量選擇合適規(guī)格酶標(biāo)板(如96孔板)，提前30分鐘取出平衡至室溫(25℃左右)。樣本需按說明書要求預(yù)處理：血清/血漿需離心去除沉淀，細胞上清需過濾除菌，避免反復(fù)凍融(建議分裝保存于-80℃)。
二、加樣與孵育：精準(zhǔn)控制是關(guān)鍵
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：用稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋(通常設(shè)6-8個濃度點)，每孔加入100μL，注意“從低到高”順序避免交叉污染；空白孔僅加稀釋液。
2.樣本加樣：待測樣本按預(yù)估濃度稀釋后，每孔加入100μL(建議做復(fù)孔，減少誤差)；若樣本濃度過高，需進一步稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。
3.封閉與孵育：每孔加入200μL封閉液(如5%脫脂奶粉)，37℃孵育60分鐘(或室溫1小時)，阻斷非特異性結(jié)合位點。
三、檢測反應(yīng)：時間與溫度嚴(yán)把控
棄去孔內(nèi)液體，洗板3次(每次300μL洗滌液，浸泡30秒)，拍干。加入生物素標(biāo)記的維多珠抗體預(yù)混液100μL/孔，37℃孵育30分鐘；重復(fù)洗板后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素100μL/孔，37℃孵育20分鐘。較后洗板5次確保無殘留，加入顯色底物(如TMB)100μL/孔，避光反應(yīng)15-20分鐘(密切觀察顏色變化，避免過顯色)。
四、終止與讀數(shù)：規(guī)范操作保準(zhǔn)確
加入終止液(如2M H?SO?)50μL/孔終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀測定450nm波長處的吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本濃度時需乘以稀釋倍數(shù)。
注意事項：全程避免氣泡產(chǎn)生(影響吸光度)；不同批次試劑盒勿混用；實驗需在潔凈臺內(nèi)操作，防止微生物污染。遵循此SOP，可顯著提升維多珠ELISA試劑盒的檢測穩(wěn)定性與數(shù)據(jù)可靠性，為后續(xù)分析提供堅實基礎(chǔ)。
